浸润与转移是恶性肿瘤的重要特征,也是影响患者生命和治疗效果的主要原因,控制转移是改善癌症患者预后的主要因素之一。 动物实验是研究肿瘤转移的重要方法,而建立一个相关的理想动物模型就成为一个重要的前提。

1969年Rygaard等首次成功将人类结肠癌移植于裸鼠后,多种人类肿瘤已经在裸鼠体内移植成功,从而开辟了利用动物研究人类肿瘤的广阔前景。以往的研究大多将癌组织直接移植于裸鼠皮下,但是这种模型由于周围结缔组织包裹,往往形成局部肿瘤而很少发生远处转移。20世纪九十年代以后国内外学者相继建立了人类肿瘤裸鼠原位移植(orthotopic tranplantation)模型,这种模型可以发生类似肿瘤临床特点的生长及转移过程。Furukawa等发现将完整组织块原位缝挂裸鼠胃壁比肿瘤细胞悬液原位移植裸鼠胃壁后转移率高。汪芳裕等在裸鼠胃壁缝制粘膜小囊包埋肿瘤组织块,这种模型肝脏转移率、腹水形成率较高。但是传统的完整组织块模型,无论是缝挂法还是胃囊法又存在许多造模时的实际困难和弊端,如造模时间长, 缝针时出血量较多,死亡率较高等。从而导致造模成功率相对不高,如何能将完整组织块不需动一针一线就可以粘挂于胃壁呢?外科用的生物吻合胶给了我们极大的启发,本研究在此基础上进一步改进,用OB生物胶将瘤组织块粘贴于裸鼠胃壁,简便易行,能完整地重现胃癌的临床转移过程,成功地建立了一种有价值的胃癌转移模型。

1、材料与方法

1.1 实验动物及细胞株

6周龄BALB/c无胸腺裸鼠24 只,雌雄兼用,体重18~20g,由中国医学科学院上海实验动物中心提供。

传代于裸鼠皮下的SGC-7901人胃癌细胞株,本实验肿瘤组织为第6代。

1.2 主要试剂与仪器

氯胺酮。医用OB吻合胶。25%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)。无血清RPMI-1640培养基干粉。秋水仙素、甲醇冰醋酸固定液、Giemsa染液和伊红染液(HE)。

高速冷冻离心机(型号:D-37520)。普通光学显微镜、多功能倒置相差显微镜(型号:PM-10AD)及生物摄影显微镜。

1.3 人胃癌SGC-7901组织块的制备

无菌条件下取人胃腺癌SGC-7901标本中的组织数块,直径约0.5~1.0cm,去除坏死组织,漂洗,滤纸吸干后置RPMI-1640液中剪成1~2mm的小块,制备成单细胞悬液(5×108~2.5×1011/L),置于18号套管针针口,碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下,局部接种。逐日观察,待肿瘤长至1.0~1.5 时处死裸鼠, 取出肿瘤组织按上述方法传代。 传代瘤鼠与实验用鼠同为BALB/c无胸腺裸鼠,本组瘤源为第6代。

1.4 模型的建立

将24只健康裸鼠随机分为3组,即皮下移植组、胃囊法组和OB 胶粘贴组,每组8只。将传代瘤鼠拉颈处死,无菌操作,从腋部皮下剥取肿瘤组织,剔除纤维包膜,切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织, 切成1mm×1mm×1mm小块,置于生理盐水中备用。皮下移植组:将切好的瘤块置于18 号套管针针口,碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下,局部接种。胃囊法组:腹腔注射50mg/kg氯胺酮麻醉裸鼠,无菌条件下沿左侧正中旁线切开,刀口约1.5cm,小心暴露腹膜、胃壁,在胃壁缝制粘膜小囊,将肿瘤组织块包埋于其中,缝合关腹。OB胶粘贴组:腹腔注射50mg/kg氯胺酮麻醉裸鼠,常规消毒皮肤,沿左侧正中旁线切开,刀口约1.5cm,小心暴露腹膜、胃壁,用一次性注射针头轻微损伤胃大弯中部浆肌层,以出血为度,将肿瘤组织用医用吻合OB胶粘合在破损处,用0号线缝合腹膜腹壁,关腹。

1.5 处死动物及观察移植瘤转移情况

12周后,裸鼠出现消瘦、活动受限、倦呆乏力等衰竭症状,部分裸鼠瘤体突出至皮下,呈蛙形腹,将裸鼠拉颈处死,肉眼观察3组移植瘤的局部生长、腹水、邻近淋巴结以及远处脏器转移情况。解剖动物,全面探查胸腹腔,取出原位移植瘤、肿大淋巴结、肝、脾、胰、肺,并测量各组移植瘤的体积,同时用电子天平称取瘤重。标本用10%甲醛固定、切片、染色后行病理组织学检查。

1.6 人胃腺癌SGC-7901细胞染色体标本制备

在无菌条件下,剪取部分原位移植瘤组织,放于无血清RPMI-1640培养液中,进行原代细胞培养。待细胞生长旺盛并长成单层时即可进行第一次传代,并制作染色体标本。在40倍光镜下观察,并用显微摄影机摄下一个细胞染色体的中期分裂相。

1.7 统计学方法

所有统计应用SAS6.12软件包,定量资料采用t检验,必要时采用单因素方差分析,定性资料采用χ2检验。

2、结果

2.1 3种模型局部移植瘤生长特性比较

皮下移植组:移植的肿瘤局部均有生长,肿瘤组织为实质性,边界清楚,呈类圆形,表面光滑或有数个结节状突起,整个瘤体组织外有结缔组织薄膜包裹,无外周组织浸润。肿瘤平均体积(1.53±0.64)cm3,平均瘤重(2.33±0.65)g切面为灰白色鱼肉状,质地较均匀,布有丰富的毛细血管网,体积大者中央有小片状坏死。

OB胶粘贴组:胃体增大, 胃底扩张,移植的肿瘤局部均有生长,肉眼可见胃壁上有灰白色鱼肉状肿瘤块,肿瘤组织为实质性,边界模糊,呈圆形或椭圆形,表面有结节状突起,向周围组织浸润生长,与网膜、脾脏等脏器有不同程度粘连,部分裸鼠有血性腹水。最大肿瘤瘤重约3.8g,瘤体平均体积(1.38±0.76)cm3,平均瘤重(2.26±0.78)g,与皮下移植组比较无显著性差异(P>0.05)。切面亦为灰白色鱼肉状,质地较均匀,布有丰富的毛细血管网,体积大者中央有小片状坏死。

胃囊法组:术后1周内,死亡2只,考虑是造模过程中缝制粘膜小囊的时间较长,出血量较多,术后恢复较差所致。肉眼观察原位移植瘤外观大体同OB胶粘贴组,局部浸润大致相同。

2.2 3种模型肿瘤转移特性比较

OB胶粘贴组与胃囊法组相比,腹膜转移率明显升高(P<0.05);远处脏器转移有所升高,但无统计学意义(P>0.05)。提示OB胶粘贴法主要是使造模操作更加简便,使成活率有所升高。

2.3 OB胶粘贴组原位移植模型病理组织学检查结果

SGC-7901胃癌组织为低分化腺癌,光镜下观察:肿瘤细胞呈圆形,核大, 畸形, 病理性分裂相多见,核仁明显,多个核仁;肿瘤细胞排列紊乱,呈巢状,血窦丰富,可见淋巴细胞浸润其中。转移灶肿瘤细胞镜下观察及病理组织学改变基本同原位移植肿瘤。

2.4 OB胶粘贴组原位移植模型人胃腺癌SGC-7901细胞染色体鉴定结果

在40倍光镜下观察,所见分裂中期细胞的染色体形态,无一是全部端着丝点染色体,证明是人的染色体, 其染色体分布为47~131,中位数为68,说明是恶性肿瘤细胞。

3、讨论

人癌转移模型的原位移植战略是目前国际上普遍接受的研究人癌侵袭和转移的重要理论基础。理想的胃肠肿瘤动物模型应该具备以下条件:⑴致癌方法简单、易行;⑵经济、快速;⑶指标客观、明确;⑷对癌变器官的特异性高;⑸重复性好;⑹诱发肿瘤的病理类型、生物学行为、电镜下表现及组织化

学改变等应与人体肿瘤相类似。种植于裸鼠皮下生长的人胃癌组织,在形态、功能、生化特征等方面与人胃癌十分相似,但因其周围有结缔组织包裹,即便是选用高转移性的肿瘤,也仅仅形成局部肿瘤,限制了其浸润及转移。原位移植模型则能够克服这一限制,结果表明移植瘤发生局部浸润、淋巴结转移及远处它脏转移,且转移率较高,部分有腹水形成,而且较好地保持了原始肿瘤的组织结构和细胞形态、功能、生化特征,转移的发展也具有与临床胃癌患者基本一致的规律,与皮下移植模型比较具有显著优越性。许多学者认为肿瘤转移不仅与其生长环境有关(土壤学说),还取决于其本身的转移潜能(种子学说),即依赖于肿瘤细胞之间、肿瘤细胞与间质、肿瘤细胞与宿主之间的相互作用(激活细胞分泌蛋白降解酶类,降解基底膜,此过程还能诱导肿瘤细胞血管产生,通过信号转导系统激活细胞的移动性,这些都是肿瘤浸润转移所必须的过程。

本实验采用的“OB胶粘贴法”造模仍然沿用当前公认的完整组织块法建立类似于人胃癌临床转移的原位移植裸鼠模型,既有原位移植的优点,又保持癌组织的完整结构,避免了细胞表面结构遭到破坏而导致恶性肿瘤生物学行为和自然属性、恶性程度的改变,能更好地模拟临床肿瘤发生与发展的过程;同时将手术方法经过适当的改进,用OB胶粘贴取代了传统的胃囊法,操作相对简便,手术时间大大缩短,对裸鼠的创伤小,术中出血少,术后恢复相对较快,故成活率明显提高;另外选用胃大弯处,因其近胃窦旁血管稠密,血液供应丰富,肿瘤生长迅速,多数可以出现幽门梗阻、腹水、远处脏器转移及恶病质等表现,能够较好地重现胃癌的临床转移过程,为人类胃癌的生长、转移机制及抗转移治疗方面的研究提供了一种较理想的动物模型;本方法操作简便,不需专业人士造模,费用相对较低,有推广的价值, 因此,采用“OB胶粘贴法”建立胃癌原位移植模型是目前研究人胃癌转移机制以及抗转移治疗较为理想的转移实验模型,该模型的成功建立为今后胃癌实验研究开辟了广阔的前景。